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4 猪瘟疫苗的研究进展目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒疫苗由于性能稳定、安全、免疫效果好,且无残留能力,是国际公认的惟一安全有效的弱毒疫苗,亦是国内惟一应用的弱毒苗。但是,考虑到当今的全球的贸易政策,使用弱毒疫苗防制猪瘟存在一个不利之处:由于疫苗毒诱导的抗体类型与动物感染野毒后恢复期动物的相似,所以不能区分免疫的和野毒感染的动物,科技工作者在不断探讨新的疫苗。 4. 1 CSFV基因缺失型弱毒疫苗病毒编码毒力的基因可予删除,留下一个低毒力的病毒颗粒用作活毒疫苗。通过非天然宿主传代选择得到的突变株,其基因组可发生多个突变,当某些与病毒复制无关的毒力或毒力相关基因缺失突变后,其毒力丧失或明显减弱,但病毒复制能力并不丧失,同时保持着良好的免疫原性。因此,通过基因工程技术致使病毒基因组中负责毒力的基因缺失,可以获得基因缺失型弱毒疫苗株。由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性,人们预测RNA 病毒缺失株的研究也将逐步开展。由于缺失型弱毒疫苗是人为地将病毒的毒力基因切除,往往不可能完全自行修复,因而不会发生返祖现象,在遗传特性上比较稳定,是今后弱毒疫苗的研究方向之一。采用缺失的方法可能会制造出免疫原性好,且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株,也可以改造现行的免疫原性还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。 Van等(2002) 构建了3个E2基因缺失的感染性DNA。一个缺失了E2基因的B, C区,一个缺失了A区,还有一个缺失了整个E2基因。此3个缺失突变均不能产生活病毒,表明E2的每一个抗原区对CSFV病毒生存都是必要的。为获得CSFV E2 缺失突变株,建立了组成性表达糖蛋白E2的SK - 6 细胞系。缺失突变株病毒可以感染该细胞系并进行复制,但不会产生具有感染性的病毒。因此,这些 E2互补病毒可以被认为是非传播的。这些缺失突变株免疫猪后,均会产生不同程度的免疫作用,并且用血清学试验可以区别于正常毒株,因此,有望成为猪瘟的潜在的标记疫苗[ 15 ] 。 4. 2 CSFV亚单位疫苗应用化学的方法从病毒粒子中分离出保护性抗原可以制成亚单位疫苗。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分,不含有核酸,因此非常安全。亚单位疫苗的免疫原性通常较低,需要与佐剂合用,或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗时,由于抗原量的限制,制备过程复杂,成本往往比较高。因此,采用基因工程的方法, 不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因,而且能够在体外对其进行改造或修饰,并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中,使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达CS2 FV免疫原蛋白,并以此表达产物为抗原可获得基因工程亚单位疫苗。 Van Rihn等证明CSFV 包膜糖蛋白E2含有一个能抵抗强毒致命攻击的结构抗原单位。 Moormann等(2000)已分别在猪瘟病毒囊膜糖蛋白 E2和Erns的基础上尝试开发出猪瘟的标记疫苗及与之相配套的诊断试验,初步的检验结果显示这种 E2疫苗和配套的诊断试验完全符合标记疫苗的概念。Bouma等实验证明, E2亚单位疫苗免疫后10d 后可完全预防猪瘟的发生,有望代替传统疫苗。对 CSFV编码蛋白的功能研究表明,囊膜糖蛋白E2是其主要的保护性抗原蛋白, E2蛋白单独免疫即可保护猪不发生猪瘟,而且E2蛋白上的中和性表位在 CSFV毒株中是保守的。这样,在E2蛋白基础上开发的亚单位疫苗不仅会赋予对抗CSFV野毒株的广泛的保护,而且很容易通过检测抗Erns的抗体将免疫的和感染的猪区分开。Hulist等将猪瘟病毒E2 基因cDNA重组入核型多角体病毒(AcNPV) ,并在 sf21细胞中表达,用20～100μg的表达蛋白免疫猪, 可抵抗100 LD50的猪瘟强毒攻击,其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。 Klinkenberg, de Smit, Ahrens等均对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验,证明其对猪有良好的保护作用,但是不能有效地防止猪瘟病毒的传播。目前有两种含有病毒糖蛋白E2的亚单位疫苗正在接受详细的审查,其中E2基因是在杆状病毒上在昆虫细胞中进行表达。由于这些细胞能够对蛋白进行糖基化修饰,所以得到的病毒糖蛋白被以一种“天然”的方式表达。CSFV的亚单位疫苗是安全的,而且迄今为止其保护潜力虽然不如活疫苗但很有前途[ 16 ] 。以杆状病毒(Baculovirus)作为载体表达异源病毒结构蛋白,杆状病毒系昆虫病毒,这种病毒能够在宿主细胞内产生大量的蛋白晶状体———多角体蛋白,这些蛋白覆盖并保护着核内的病毒粒子。该蛋白的表达受多角体蛋白启动子调控。通过痘苗病毒等在细胞内表达的外源性病毒蛋白,经提纯后对动物也具有一定的免疫原性。杆状病毒- 昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白,昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似,所表达的蛋白 “仿真”程度较高,已成为众多亚单位疫苗研究的工具。由于该疫苗生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点,同时又可根据流行毒株的变化更换合适的 CSFV E2基因,因此具有广阔的应用前景。亚单位疫苗安全性好,如果其免疫原性能够得到根本改善, 会大大加快其临床应用进程。 4. 3 CSFV活载体重组疫苗伪狂犬病病毒( Pseudorabies virus, PRV)基因组为一线性DNA分子,约150kb,外源基因可稳定地插入其DNA。将与PRV毒性相关的糖蛋白I( gI) 与胸苷激酶(TK)基因灭活,使PRV弱毒化,从而成为发展亚单位重组疫苗的一个较理想载体,将CSFV E2基因克隆到该病毒活载体上,即可获得对伪狂犬病和猪瘟的双重保护。Rumenapf等(1991)首先在痘苗病毒中表达了猪瘟病毒的结构蛋白。将痘苗病毒重组子注入小鼠和猪体内,均产生诱导猪瘟病毒中和抗体的产生。而猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒(如伪狂犬病毒)将是很有希望的候选载体[ 17 ] 。目前用于表达外源性病毒蛋白的载体包括伪狂犬病毒( PRV) 、痘病毒(VAC) 、腺病毒、疱疹病毒和小RNA病毒等。以无致病力或低毒力的活病毒为载体,将猪瘟病毒E2 基因与之重组研制出的基因重组疫苗,免疫动物后可对2种病毒产生良好的保护力,但目前对此类疫苗的安全性和实用价值还有争议,因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机制,也就无法控制这类“人造”病毒的未来走向,一旦将该病毒放入自然界中,重组疫苗载体株与其他弱毒疫苗或野生株病毒之间的异常遗传信息交换,同源或非同源重组后会产生一携有外源基因的强毒性突变株,有可能改变其生物学特征,衍变出对人、兽有害的病毒变种,鉴于对人类和环境可能造成潜在危害,限制了这一类载体的发展,另一方面,利用较为普遍的病毒作为活载体所获得的CSFV活载体重组疫苗对于该活载体相应病毒感染或已免疫的动物不能产生保护力。 4. 4 CSFV DNA疫苗 DNA疫苗是近年发现并形成的一种新的疫苗研制技术,已有许多用该技术将一些具有药用价值的活性蛋白基因与载体重组,注射动物后成功产生活性蛋白的例子。Markowska 等( 2001 ) 对CSFV DNA疫苗进行了测试,经临床观察证明,可以抵抗强毒攻击,但是会出现40℃以上的高烧。免疫后可以测出轻微的T、B细胞反应。余兴龙、Hammond和 Andrew等分别构建了CSFV E2基因的重组表达质粒,并且证明它们对猪有较好的保护作用。周鹏程等(2000)用构建的真核表达质粒DNA pcE2肌肉接种小鼠可诱导产生CSFV中和抗体。DNA疫苗的研究对于新型非复制型疫苗预防猪瘟具有十分重要的意义。周鹏程等(2001)实验证明,针对CSFV 5’端非编码区NS3 蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核苷酸对CSFV复制均有显着的抑制作用,这种特异性的寡聚核苷酸有可能成为抗CSFV的新型药物或 DNA疫苗[ 18 ] 。 4. 5 CSFV全长感染性cDNA标记疫苗全长cDNA标记疫苗是在分子水平上,将具有选择性标记的基因,替换或克隆到致弱病毒全长 cDNA中,获得的重组病毒免疫动物后,可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫,从而鉴别出感染猪群和免疫猪群,标记疫苗的开发有可能成为猪瘟疫苗发展的一个主要方向。 Smit等将疫苗株重组病毒的E2和Erns部分序列分别用BVDV相应区段替换构建了两个镶嵌病毒,在免疫1～2周后,即可对猪产生较好的保护作用。经重组病毒接种的猪,可以抵抗致死剂量猪瘟病毒的攻击,即使不能诱导中和抗体的重组子也可产生保护性的免疫力。Moser于1998年,将编码细胞氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acethl trans2 74 基因插入到CSFV Alfort/187 株全长 cDNA克隆pA187 - 1 的Np ro基因中。经过检测, 在感染细胞中vA187 - CAT的预计融合蛋白CAT - Pro,保留了CAT和Np ro二者的酶活性。插入病毒的CAT基因在病毒传过10 代后依然保持稳定。 2000年,De SmitAJ等利用CSFV疫苗毒株,中国C 株的基因组DNA拷贝构建了2个重组CSFV ( Flc2、 Flc3) 。实验表明,重组病毒在兔和猪中保留了父代 C - 株的生物学特性和免疫原性。C - 株全长cDNA 可作为基质以开发活的重组CSFV标记疫苗。 CSFV全长感染性cDNA标记疫苗,可有效地区别自然感染猪群与疫苗免疫猪群,为建立快速、准确的CSFV诊断试剂盒奠定基础,因此极有希望成为猪瘟非免疫政策的一个有用工具。同时, CSFV C株全长感染性cDNA标记疫苗的研制和开发,有望为我国C株弱毒苗在西欧等国的推广铺平道路。 |
