|
猪瘟(CSF)是猪的一种最重要的传染病,早期称为猪霍乱、烂肠瘟。欧洲为了区别于非洲猪瘟称其为“古典猪瘟”。其病原是猪瘟病毒(HCV \CS2 FV) 。猪瘟病毒是RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员。CSF病理特征是小血管壁的变性,致使内脏器官多发性出血、梗塞和坏死,以出血和发热为主要特征,呈急性或慢性经过,对养猪业危害极大[ 1 ] 。 1 猪瘟概述 1. 1 猪瘟的流行和分布猪瘟病毒主要通过直接接触进行传播,感染猪成为传染源。发生急性感染的猪在尚未表现任何临床症状之前,就能通过其分泌物向外散播病毒。健康猪直接或间接接触感染猪以及接触污染的器具都会感染发病。带毒动物虽不表现任何临床症状,却能够将病毒传染给其他动物,因此在猪瘟的传播中具有更高的潜在危险性[ 2 ] 。生猪运输、人工授精、肉品的销售等亦会造成病毒的人为传播[ 3, 4 ] 。另外,因为野猪和家猪对猪瘟同等易感,野猪群的形成、密度和行为亦会造成猪瘟的流行,猪瘟在野猪中的流行不总是局限于本群,病毒毒力、地区特征、猪群的密度、大小和流动程度等因素不同,可能导致地方性的野猪成为猪瘟的持续性传染源,威胁着附近的家猪。猪瘟的发现已180多年,虽然世界各国在对该病的防控上做出了巨大的努力,而且在北美、澳洲和北欧的一些地区曾成功地消灭了猪瘟,但猪瘟在世界的许多地区仍广泛流行。墨西哥、巴西、南美的大部分地区猪瘟仍呈地方性流行。在加勒比地区古巴、海地和多米尼加都存在猪瘟[ 5 ] 。在亚洲的日本[ 6 ] ,最早的猪瘟暴发是在1888 年,从那以后报道有许多病例。自从1969年在全国使用GPE株弱毒疫苗,猪瘟的暴发明显减少。在东南亚地区,猪瘟在大多数国家仍间歇发生,在中国的大陆和台湾地区也有猪瘟流行,其中大陆多以散发和慢性病例为主[ 7 ] ,自20世纪80年代以后,温和型猪瘟增多,而且猪瘟的发生有上升趋势,貌似健康的持续带毒猪占20%～30%,每年由猪瘟致死的猪占 总死亡数的1 /3 ,经济损失在20亿元左右。欧盟成员国的家猪中曾无猪瘟流行,但1990年后,在家猪群中又出现了猪瘟的暴发,在德国、荷兰、比利时、意大利、奥地利、西班牙、瑞士和英国等国都有猪瘟暴发[ 8, 9 ] 。近年来,在奥地利、法国、德国、意大利和瑞士等西欧国家的野猪群中也发现了猪瘟的暴发和流行。在中东欧国家如阿尔巴尼亚、波黑、捷克、拉托维亚、波兰、罗马尼亚、俄罗斯和匈牙利等, 养猪业是其农业经济中的重要部分,猪瘟在所有的中东欧国家都存在[ 10 ] 。 1. 2 猪瘟的临床症状和致病机理在自然条件下, CSFV通过口腔黏膜感染。典型猪瘟的潜伏期为7～10d。感染猪出现结膜炎和白细胞减少,感染4d后即可规律性地出现这些症状,实验证明, CSFV对同源或异源的白细胞均具有凝结作用。猪瘟的典型症状是皮肤和黏膜的斑点性出血,但并不是始终都能观察到。中枢神经系统紊乱,便秘及随后的腹泻也是特征性的临床症状。临床症状的严重性在很大程度上取决于动物的年龄和病毒毒力,通常对幼龄动物的影响更严重。仔猪感染猪瘟后,病死率可达90%。大猪感染后的过程中有时呈非典型和温和性。猪瘟病毒对动物体内的靶细胞是内皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和一些表皮细胞。病理变化因临床症状的不同而异。出生前在个体发育的早期阶段,病毒影响器官的分化而导致产生畸形。出生后的感染主要引起内皮的损伤和出血体质的血栓。组织病理学变化不是特定的,病理损伤可能包括淋巴组织的实质变性,血管内皮组织的细胞增生,非化脓性脑膜脑炎。在急性感染的末期, 循环系统和淋巴组织中B 淋巴细胞减少。在急性感染期间,可引起感染猪免疫抑制。恢复的猪免疫期可长达几年甚至终生。最早可在感染后2周检测出中和性抗体。而在慢性病例,感染近1个月才可以检测到猪瘟病毒中和性抗体,随后抗体消失。持续性病毒血症的感染猪,很少产生特异性抗体。母源抗体半衰期约14d。被动免疫通常在第5周对仔猪产生保护,但不能阻止病毒的复制和散播。近年来,我国猪瘟的流行和发病特点已发生了很大的变化,其流行形式已从频发的大流行转变为周期性、波浪性的地区性散发性流行。通常3～4周一个周期,疫点显著减少,多呈散发性流行。在发病特点上,出现了所谓非典型猪瘟、温和型猪瘟和无名高热。非典型猪瘟的表现形式主要有两种,一种是繁殖障碍型猪瘟,主要发生于生产母猪,其本身呈阶段性感染,并无明显的临床症状,但能通过垂直传播危害下一代,导致胚胎死亡和仔猪的成活率下降。病毒能通过胎盘屏障传染给不同时期的胚胎,产出木乃伊胎、死胎和弱仔。有的仔猪出生后就表现精神沉郁、震颤、间歇性腹泻,有的发生呕吐和运动失调,皮肤出现出血斑块、皮下水肿等症状,病仔猪常在2～3d死亡,病死率很高。这种病例一般不发生水平传播,发病率的高低,与带毒母猪的多少有关。本型病例的剖检病变与典型猪瘟有相似之处,但病变程度较轻。典型病变出现的概率较少,如在咽喉、肾脏、膀胱黏膜等处有不同程度的出血小点,淋巴结出血、充血和水肿,胃肠道有出血性炎症。隐性感染母猪所产仔猪,出生后一段时期内表现健康,在哺乳期内生长良好,一旦断奶后,仔猪即连续出现病状。体温升高达41℃左右,厌食。特征性的症状是顽固性腹泻,粪便由褐色变成黄色。后期由于肛门失禁, 粪便沿着后腿流下,恶臭。病猪迅速消瘦,腹下部及耳根皮肤呈紫色。治疗无效,病程1周左右,以死亡而告终。剖检的主要病变是胃肠道有不同程度的充血、出血,大肠段有溃疡,全身淋巴结水肿、充血和出血,仅有部分病例(约占1 /10)的肾、膀胱黏膜呈现小点出血。另一种表现形式是慢性(温和型)猪瘟, 见于猪瘟流行的老疫区或流行后期的耐过病猪,也可能发生在猪瘟免疫接种制度不健全的农村散养猪。本病型主要经水平传播,各种日龄的猪都可感染,但以青年猪和肥育猪较为多见。病程长达1～2 个月,病情发展缓慢,呈散发流行,在一个地区或猪场内不易根除。病猪的体温稽留在40℃左右,症状时轻时重,食欲时好时坏,粪便时干时稀。病程较长者,皮肤出现淤血斑和坏死块,以腹下部为多见。有时也出现紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。据报道,这种病猪的皮肤一旦破损或扎针后,局部流血不止,即血液凝固不良,也是本病的特征之一。病猪日益消瘦,日龄越小,病死率越高。部分育肥猪经1～2个月后可能耐过,但失去经济价值。慢性猪瘟的主要病变与典型猪瘟接近,但较为轻微,如淋巴结轻度出血或只有水肿现象。肾、喉及膀胱黏膜有少量出血点,脾脏稍肿大、边缘有1～2处小梗死灶。回盲瓣肠段可出现溃疡、坏死,但难得见到扣状溃疡的病变。用多种实验室诊断的方法可查出猪瘟病毒。 1. 3 猪瘟的检测近年来,病毒RNA的检测已成为实验室诊断中较为理想的方法,已被作为利用反转录聚合酶链式反应(RT - PCR)扩增的对象[ 10 ] 。RT - PCR具有快 速、敏感等优点,特别是样品不理想时更有价值。它的另一优点是可以测出扩增cDNA的序列,快速确定病毒特性,在流行病毒研究中更有价值。在此基础上又产生了cDNA探针及RFLP确认PCR产物。单独使用探针可能不太敏感,但若用cDNA杂交方法与PCR结合,则可通过利用高度保守区cDNA序列为CSFV的诊断提供有力的工具。进一步鉴定基因组,可将PCR产物进行序列分析[ 11, 12 ] 。若用第二套引物去扩增第一次反应生成的PCR产物的“亚片段”,此方法称为“套式PCR”( nested - PCR) ,更可以提高检测的特异性。目前使用的某些CSFV诊断方法普遍面临的一个难题是诊断抗原必须连续不断的用细胞培养或感染动物生产。这种方法制备的抗原,代价高,往往保存期短,每一批新抗原均需进行标化,还可能潜含细胞培养苗免疫动物可识别的其他抗原,并可产生假阳性。用重组DNA生产特异抗原技术,可以克服抗原必须连续不断的用细胞培养或感染动物生产这一难题。当以竞争EL ISA形式使用重组抗原时,不需要提纯由细菌溶解生产的重组抗原, 因为竞争 EL ISA特异性仅存在于单克隆抗体。Barlic - Ma2 ganja等(2001)利用RT - PCR技术结合特异性捕获探针杂交和比色分析,可以快速、简便、特异地鉴定猪瘟病毒,并可克服污染和假阳性结果的产生[ 12 ] 。 2 CSFV分子的免疫学性质 CSFV是具有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒粒子的直径为34～50nm,略呈圆形,具有脂蛋白囊膜,囊膜上有6 ～8nm 的类似穗样的糖蛋白纤突。病毒粒子有20面体对称的核衣壳,内部核心直径约为30nm。已知序列的各毒株在编码区的基本数目相同,均为11 697个碱基(不含终止密码子) ,由一个连续的大开放阅读框构成,理论上可编码一个由 3 898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。这个多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内裂解为12种病毒特异性蛋白质,其中4种为病毒结构蛋白, 8种为非结构蛋白。其中具有免疫性质的有E0 /Erns, E1, E2等3 种糖蛋白[ 13 ] 。 E2 ( gp55)是3种囊膜糖蛋白中最为重要的一种,其N端为Arg690, C端尚不十分确定,Wensvoot 等(1990)研究证明, E2是CSFV的主要抗原结构蛋白,在随后的实验中发现,表达CSFV B rescia株E2 蛋白的重组伪狂犬病毒以及用亲和层析法从昆虫细胞中纯化的基因工程E2蛋白,均能保护免疫猪抵抗CSFV的感染,从而证实, E2蛋白诱导的免疫反应足以保护被免疫猪抵抗CSFV的感染,而提供有效保护。Rumenapf等( 1991)将覆盖有CSFV 结构蛋白基因区的一段cDNA片段插入疫苗毒tk基因中,获得能表达四种结构蛋白的疫苗毒/CSFV重组体,该重组体在鼠和猪体中能诱导病毒中和抗体的产生,并能完全保护猪免受致死性强毒的攻击。为了进一步验证是否保护性免疫反应的产生依赖于 CSFV gp55 的存在,作者用Kpn I - Rcor消化PHC 3. 8质粒,并用外切酶Ⅲ处理后产生VAC3. 8 3’端缺失的约1. 4kb 的片段,该片段连接于PGS62 质粒中,产生了缺失大部分gp55编码区的VAC3. 83 突变株。用VAC3. 83 感染猪后第4周无法检测到抗 CSFV的中和抗体,但能引起保护性反应,从而证明 CSFV中和抗体的诱导很大程度上甚至完全依赖于 gp55的存在。 E0 ( gp44 /48)是第2个被发现能介导中和免疫应答的抗原, N 端为Glu - 268,含227个氨基酸残基,它也是惟一大量分泌到CSFV侵染的细胞外环境中的糖蛋白。这一点能用它没有膜着锚位点来加以解释,也正因此,目前还不清楚E0以何种机制与 CSFV粒子连接而位于病毒粒子表面。但已证明, E0具有诱导中和抗体产生的能力,同时认为E0具有RNase活性, RNase的不同生物活性表现为参与 RNA基因表达过程、模板RNA的消化、行使细胞毒作用、参与抗肿瘤及免疫调节过程,因为CSFV感染引起白细胞减少症和免疫抑制, Christianne 等 (1997)研究了E0的免疫调节作用,作者发现,该糖蛋白完全抑制由ConA引发的猪、人、牛、羊的淋巴细胞增殖反应,在蛋白质合成实验中, E0强烈抑制不同种类淋巴细胞的蛋白合成,但无细胞膜破坏现象。这说明E0引起淋巴细胞的凋亡过程,从而证实了E0在CSFV病理学中发挥着重要作用。 E1 ( gp33)其N端为leu495,是3种糖蛋白中分子质量最小的一种。E1不产生中和抗体,在CSFV 感染的细胞抽提物中, E1常与E0以异源二聚体的形式形成免疫共沉淀, E1可能通过与E0形成复合抗原结构而起作用。 3 猪瘟病毒的进化和遗传分型根据CSFV的毒力、抗原性、致病性及血清学特性的差异,一些学者认为CSFV至少应分为2个血清型(群) ,一是包括许多猪瘟强毒株和绝大多数用作疫苗的弱毒株,二是包括引起慢性猪瘟的低毒力 毒株。法国的Corthier (1974)和Aynaud (1976)提出将CSFV分为A,B两个群, A群包括流行的强毒株和由强毒株人工培育成的弱毒株,如中国系兔化毒 (C株) 、日本的GPE - 株( GPE - 阴性株,即日本疫苗株) 、法国的疫苗株( Thiveval株) ; B 群包括自然分离的无毒、低毒和中等毒力的毒株等,这些都是天然变异株。如美国的331株、我国四川、河北、江苏、北京也都分离到温和型CSFV株。日本的上条泰雄 (1977)将CSFV 分为H 群和B 群, H 群相当于A 群,B群主要包括1972～1973年,以及1980年在日本分离到的慢性猪瘟野毒株。两种分群方法所不同的是GPE - 株在日本将其归属B群。 CSFV可能是瘟病毒中最不易发生变异的一个种,不过利用单抗对其进行分型表明, CSFV可以进一步分为不同的群和亚群,其中区分最明显的是在古典的分离株和最新的分离株之间。病毒亚型的鉴定将会增进对CSFV进化和流行的了解,并可能给出生物学特性和毒力的差异。技术的进步使得在确定和比较病毒基因组片段的核苷酸序列的基础上进行病毒的遗传分型已很容易了,可以用这种方法来建立不同病毒分离株之间的联系,这对于分类是很有用的,而且能够帮助追踪病毒传播的类型,发现防控策略中薄弱环节。遗传分型可以对造成病毒持续性感染和传播的可能原因的假设进行评估。对分离自一系列暴发区域、具有相互联系的的毒株的遗传比较可用来使对于遗传分型的理解更加有效,并可确定病毒在自然界突变的速率。遗传分型已被证实是一种追踪CSFV传播的极为有用的方法,一般认为要优于抗原比较的方法,该方法已被用来证实: ① 病毒从传入地点的散播; ②在家猪和野猪之间的传播; ③跨国界传播; ④关系极其相近的病毒的不同毒力的暴发; ⑤特别的变异毒株在本地的持续存在,最可能在感染的野猪; ⑥区分野毒株和流行毒株。毒株间可能的差异取决于用于比较的基因组的靶区域的长度和变异性。关于基因组的哪一区域应用来进行遗传比较,哪一种比较方法最有意义目前尚在争论当中。在不同基因组区域序列比较的基础上的 CSFV树形关系的研究将其分为两个主要的基因群 (Group)和另外两个完全不同的分离株———Kanaga2 wa和Congenital Tremor。Group1又进一步分为3个基因亚群( Subgroup ) ,即Subgroup1. 1, Subgroup1. 2 和Subgroup1. 3; Group2也进一步被分为3个基因亚群( Subgroup) ,即Subgroup2. 1, Subgroup2. 2和Sub2 group2. 3。5’UTR, E2和NS5B基因是CSFV遗传分型时应用最广泛的基因组上的区域,对这3种分型方法结果进行分析比较表明,利用NS5B 进行遗传分型其结果的可信度最高。Harasawa以5’UTR为依据研究一些猪瘟病毒的基因型,但Paton等认为, 以5’UTR进行分型的可信度最低[ 14 ] 。在遗传分型基础上构建的系统发生树,不仅能够显示各毒株之间差异并在它们之间建立起联系, 同时也有助于对CSFV 分布和传播的了解。在欧洲,除了20世纪60年代分离自英国的、极其不同的 Congenital Tremor毒株外,所能得到的所有的1920 ～1970 年间分离的病毒均属于Group1。与Al2 fort187株相似,这一时期大多数的分离株属Sub2 group1. 1。分离自意大利的B rescia毒株是较早期 Subgroup1. 2的一个代表。如果不是所有的话,那么大多数的修饰的活疫苗也被认为来源于这一时期的 Subgroup1. 1或Subgroup1. 2的分离株,在欧洲没有发现Subgroup1. 3的病毒。自从1970年以来,除了 1989年从比利时和20世纪90 年代从乌克兰分离到Subgroup1. 1和Subgroup1. 2毒株外,很少分离到 Group1病毒。而实际上, 20世纪80～90年代分离的所有的病毒均属于Group2。最早出现的Sub2 group2. 3的病毒是1982年在德国,随后在其他国家发现这些病毒,到目前包括了意大利、撒丁岛、法国、比利时、英国、澳大利亚、瑞士、匈牙利、捷克共和国、波兰和斯洛文尼亚共和国。CSFV 的Subgroup2. 2 和Subgroup2. 3的病毒更是局限于这一区域。1985 年以来在中欧、澳大利亚、捷克共和国、德国、意大利、罗马尼亚和匈牙利发现了Subgroup2. 2的病毒。反复从欧洲的不同区域的野猪中分离到Subgroup2. 2 和Subgroup2. 3 的病毒。Subgroup2. 1 的病毒在 1997年大流行之前仅有零星的报道。在1997 ～ 1998年期间,该病毒被认为是首先从德国引入荷兰,随后传播到意大利、比利时和西班牙[ 169 ] 。在美洲,迄今为止仅有Group1病毒被报道,历史上20世纪40～50 年代分离的毒株都是Subgroup1. 1 的病毒,此后80年代和90年代早期又先后从巴西和墨西哥分离到了该亚群病毒,不过从洪都拉斯也曾分离到一株Subgroup1. 3的病毒。近年来古巴猪瘟的暴发则与Subgroup1. 2 的毒株有关。在亚洲,在不同区域和不同的时期CSFV的所有的基因群和亚群的病毒都存在。1966 年从日本分离到了Sub2 group1. 1 的病毒Hokkaido 株,随后又分别于1971 年和1974年分离到了Subgroup2. 3的Osaka株和一个完全不同的Kanagawa株。中国在20世纪50年代流行的石门毒株和在其基础上衍化出来的猪瘟兔化弱毒株均属于Subgroup1. 1 的病毒,近年来流行的毒株中,属于各个基因群和亚群的毒株都有,其中 Group2特别是Subgroup2. 1和Subgroup2. 2是引起 CSF广泛流行的2个主要的亚群。在亚洲的其他地区, 20世纪80年代在泰国发现了Subgroup1. 1的病毒,在马来西亚发现了Subgroup2. 1的病毒,同时在两国均发现了Subgroup1. 2 的病毒。Subgroup2. 2 的病毒在泰国被发现是在20世纪90年代,这一时期还分别从朝鲜和泰国分离到了既不属于Group1 又不属于Group2的病毒[ 172 ] 。这方面的研究,不仅能够反映CSFV毒株的遗传关系,而且还隐喻毒株间的免疫关系,对于防制猪瘟是十分必要的。 |
