关键词：猪流感病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；猪瘟病毒；猪圆环病毒2型；猪伪狂犬病病毒；混合感染

猪流感(Swine influenza，SI)是由猪流感病毒(Swine influenza virus， SIV)引起的一种急性呼吸道传染病，多发生于冬季、早春等气温骤变天气，其特征为突然发热、咳嗽、呼吸困难，鼻中流出分泌物，猪不分年龄、品种和性别均能感染[1]。目前已遍布美洲、亚洲、欧洲和非洲等世界各地，已成为规模化猪场的常发传染病[2]。单纯发生猪流感，发病率高而死亡率较低，猪只表现为健康状态不佳和生长性能下降，但SIV常与其他病原体的继发或混合感染，使疫情复杂，病情加重，死亡率增高[3]。SIV还是呼吸道疾病综合征的主要病原体之一，感染后常发生肺炎，怀孕母猪感染SIV时，可引起繁殖障碍[4]。为了解SIV与其他病原体混合感染的情况，在初步诊断的基础上，采用RT-PCR方法，对37份疑似SIV感染样品进行检测，同时还运用RT-PCR和PCR方法，对SIV阳性样品进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)特异的目的基因片段扩增。

1　材料与方法
1.1　病料取材
从广西和海南等省区的4个发病猪场有临床症状的病猪无菌采取37份病料(肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体和脑等组织)，置－20℃冻存。
1.2　主要试剂
总RNA抽提试剂TRIZOL购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶购自Promega公司；RNase Inhibitor购自TOYOBO公司；dNTP和TaqDNA聚合酶购自天根生化公司；DNA Marker DL 2000、蛋白酶K购自TaKaRa公司。
1.3　引物合成
检测SIV所用引物按文献[5]进行合成，扩增A型流感病毒核蛋白(NP)基因的特异性引物，NP1200：5′-CAG(A/G)TACTGGGC(A/T/C)ATAAG(A/G)AC-3′；NP1529：5′-GCATTGTCTCCGAAGAAATAAG-3′，预期扩增目的片段长度为330bp；检测PRRSV所用引物按文献[6]进行合成，预期扩增目的片段长度为433bp；检测CSFV所用引物参照文献[7]进行合成，预期扩增目的片段长度为508bp；检测PCV-2所用引物参照文献[8]进行，预期扩增目的片段长度为1 154bp；检测PRV所用引物参考中华人民共和国猪伪狂犬病诊断技术标准进行合成，预期扩增目的片段长度217bp。以上5对引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
1.4　病料中总RNA的抽提取约1 g病猪肺脏、脾脏和淋巴结于研磨器充分研磨，用Hanks液/PBS/生理盐水1∶5稀释，反复冻融3次以上，8 000r/min离心10 min，取上清液350 μL，加入800 μL的TRIZOL，混合均匀，室温放置5 min～10min。加入200 μL氯仿，旋涡振荡15 s混匀，室温下放置2 min～3 min，12 000 r/min离心10min。取上清转移到新的EP管，再加入等量的异丙醇(约700 μL)混匀，室温下放置10 min。12 000r/min离心10 min，弃上清，再加入750 mL/L乙醇1 000 μL，旋涡振荡混匀，12 000 r/min离心5min，弃上清。晾干EP管中的提取物，用无RNase的水35 μL溶解，置－20 ℃冻存备用或即用。

1.5　SIV目的基因片段扩增
RT-PCR反应体系：10×PCR buffer 3.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 3.0 μL，上游引物(25 pmol/μL)1.5 μL，下游引物(25 pmol/μL) 1.0 μL，RNA模板 4.0 μL，1.0 μLTaq DNA聚合酶(5 U/μL)，RNasin 0.5 μL，M-MLV反转录酶 0.5 μL，加水至25 μL。反应参数：42 ℃反转录45 min；95℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR产物，在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统上观察目的片段。
1.6　PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV目的基因片段的扩增
应用建立的RT-PCR和PCR方法，对病料进行PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV的检测，方法参照文献[9-12]进行。

2　结果
2.1　SIV的检测
采用RT-PCR技术，利用SIV特异性引物，分别从4个猪场的病料中均扩增出了SIV基因片段，长度为330bp，与预期的结果一致，表明所检测的病料为SIV。
2.2　SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV混合感染的检测利用RT-PCR和PCR方法对送检样品进行了其他可疑病毒的检测，结果发现SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV有混合感染现象。
从表1可以看出，SIV感染的4个猪场的发病时间都为2005年3月份，且这4份病料都为2种或2种以上病毒混合感染，其中，采自海南省和玉林市的2份病料分别为SIV/PRRSV和SIV/PCV-2二重感染，采自南宁市和柳州市的2份病料分别为SIV/PRRSV/PRV和SIV/PRRSV/CSFV三重感染，可见SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2、PRV的混合感染还是比较常见。

3　讨论
广西南宁市、柳州市、玉林市和海南省的4个猪流感发病猪场的发病时间均为2005年3月份，天气骤变，发病突然，病猪体温升高，食欲下降或废绝，精神[CM21－22]委靡，呼吸急促，呈明显的腹式呼吸或张口呼吸，阵发性咳嗽或打喷嚏，鼻中流出清亮的液体或浓稠的分泌物。猪场未接种过SIV、PRRSV和PCV-2疫苗。
经剖检，病理变化主要为鼻、喉、气管和支气管黏膜充血，表面有泡沫状黏液；气管内有泡沫；有的心包积液并有出血点；肺部病变不一，有的表现为肺炎、水肿和局部出血，有的出现肉变和坏死灶；淋巴结肿胀；有的肾脏表面有出血点，脾脏边缘有梗死灶。

SIV感染可损害猪呼吸道上皮细胞，降低或丧失了呼吸道黏膜的屏障作用，患病猪很容易继发或并发猪的其他疾病如传染性胸膜肺炎(APP)、猪2型链球菌(SS2)病和PRRS等疾病[3]，使病情加重。PRRSV和PCV-2在呼吸道疾病发生过程中也起到了很大的作用，都能侵害机体的免疫系统而导致感染猪的免疫抑制，有利于SIV和CSFV等病原体的感染，正是由于多种病毒间的相互促进作用，使病情加剧死亡率增高，给养猪业造成严重的经济损失。过去人们普遍认为，SIV感染没有特异的治疗方法，一般情况会自然康复，但是，现在混合感染现象已非常普遍，因此在预防和诊断猪的传染病过程中应引起足够的重视。在防控猪流感实践中，必须采取综合性预防控制措施，做好各种常发病的免疫接种和药物预防，提高猪群整体抵抗力和健康水平。另外，越来越多的资料显示，感染猪的流感病毒具有感染人的潜力，尤其是经过猪体进行基因重排后的流感病毒更具有感染人的可能性，猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒种间传播链中起着中间宿主的作用，因此，猪流感的防控对提高人类的健康，具有重要的意义。